培養細胞からの核抽出液調製法（廣田 恵子）
最初に低張液で細胞を壊し、次に高張液を加えることにより核内の蛋白質を抽出する。
<10 cm dish>
↓PBS(-) 3 ml wash x2 times
↓Add PBS(-) 1 ml
↓Scraperにて回収
↓Cfg.4100 rpm.(1500g) 3 min.
↓(pellet) resuspend in buffer A 300 ul
↓on ice 15 min.
↓add 10% NP-40 18.75 ul
↓Vortex max 10sec.
↓Cfg. 2500 rpm.(500g) 3 min.
↓(pellet) resuspend in buffer A 300 ul x2 times
↓pipetting
↓Cfg. 2500 rpm.(500g) 1 min.
↓(pellet) resuspend in buffer B 200 ul
↓on ice 15 min.(vortex)
↓cfg.15000 rpm.15 min.
↓(sup) nuclear fraction
Buffer A
Final Stock Add
10 mM HEPES (pH7.9) 1 M 30 ul
10 mM KCl 1 M 30 ul
0.1 mM EGTA 0.5 M 0.6 ul
0.1 mM EDTA 0.5 M 0.6 ul
1 mM DTT 1 M 3 ul
0.5 mM PMSF 100 mM 15 ul
proteinase inhibitors
A.C.ed milliQ 2920 ul
3 ml
Buffer B
Final Stock Add
20 mM HEPES (pH7.9) 1 M 20 ul
400 mM NaCl 5 M 80 ul
1 mM EGTA 0.5 M 2 ul
1 mM EDTA 0.5 M 2 ul
1 mM DTT 1 M 1 ul
1 mM PMSF 100 mM 10 ul
proteinase inhibitors
A.C.ed milliQ 885 ul
1 ml
Reference: NucleicAcids Research (1989) 17; 6419-