目的 : 各種実験に用いるplasmidを大腸菌から大量に調整する
preculture
↓ 目的のplasmidを持った菌体を2 mlのLA-broth で培養 (O/N)
↓ この間に1 L容三角フラスコ、100 ml容メスシリンダーをオートクレーブする
main culture
↓ 1 L容三角フラスコに100 ml のSuper Broth をはかりとる
↓ そこへ preculture 後の菌体懸濁液を decant で入れ、37℃、O/Nで培養
prep
↓ 菌体懸濁液を三角フラスコからdecant で50 ml tube に移し、c.f.g. 3,500 rpm, 5 min.
↓ sup. 除去。菌体懸濁液量が多い時はここにさらに菌体懸濁液を加え同様に遠心する
↓ 1x lysozime solutionを2.5 ml 加え、ボルテックスしペレットを完全に懸濁させる
↓ アルカリSDSを5 ml 加える
↓ 続けて素早く3 M KoAc を3.75 ml 加えボルテックス
↓ c.f.g. 3,000 rpm, 5 min (この間に新しい50 ml tubeにφ/cを10 ml 入れておく)
↓ sup. を回収する (このときtubeを傾けて水面の不溶成分をtubeの壁にくっつけるとよい)
↓ ボルテックス、c.f.g. 3,000 rpm, 5 min (この間に新しい 50 ml tubeにIp-OH 10 ml を用意する)
↓ sup.を回収しIp-OHへ
↓ c.f.g. 7,000 rpm, 7 min, 4℃
↓ decant でsup除去
↓ 70 % Et-OH rinse, dry-up
↓ RNase-TE 5 ml 加え、37℃, 10 min incubate
↓ 15 ml tubeにdecantで移し、3 mlのPEG solutionを加え、ボルテックス、on ice >15min
(この間に、新しい50 ml tube にCsCl を2.500g 正確にはかりとる)
↓ c.f.g. 7,000rpm, 7 min. 4℃
↓ 70 % Et-OH rinse, dry-up (70% Et-OH を入れた時点でかすかにDNA ppt. が見える)
↓ TE 3 ml によく溶かし、KoAc 300ul, φ/c 3 ml 加え、ボルテックス
↓ c.f.g. 3,000 rpm, 5min. R.T (この間に 新しい15 ml tubeに100% Et-OH 6 ml 入れておく)
↓ sup.を回収し100% Et-OH へ (このとき、DNAが綿のように析出してくる)
↓ c.f.g. 7,000 rpm, 7 min. 4℃
↓ 70% Et-OH rinse dry-up
↓ 全量が1 ml になるようにTEに完全に溶かす。
↓ O.D.メーターでDNA 濃度をはかる
↓ DNA量として最大で800 ug分のDNA溶液をTEで2.4 ml にメスアップする
↓ これをCsClの入った50 ml tubeに入れ、Et-Brを120 ul 加え、よく攪拌してCsCl を溶かす
↓ 超遠心用tubeに移し、超遠心する (10,000 rpm, 5-10hrs, R.T)
↓ tubeからc.c.c. のバンドを注射器を用いて1.5 ml tube に回収する
↓ c.c.c. 溶液とだいたい等量の1-Bt-OH を加え、ボルテックス
↓ 1-Bt-OH層へ移った Et-Brを除去
↓ この操作をEt-Btの色がなくなるまで繰り返す
↓ c.c.c.溶液を半分ずつ二本のチューブに分ける
↓ MILLIQを400 ul、100% Et-OH を800 ul入れエタ沈
↓ 70% Et-OH rinse (CsClが多量に入っていたので十分に洗浄する)
↓ dry-up
↓ 1 γより薄まらないようにTEで溶かす (だいたい100-200 ul)
↓ 十分に溶かしてから濃度をチェックし、さらにTEを用いて濃度を調整する
↓ 最後にアガロースゲル電気泳動し、そのバンドを実際に確認する