ルシフェラーゼアッセイ（新谷 奈津美）
ルシフェラーゼ遺伝子産物の発光を利用して，遺伝子の転写活性を制御するプロモーター/エンハンサー/サイレンサーの活性の解析やそこに作用する転写調節因子の影響を調べる方法である．
1. 使用機器
ルミノメーター（Wallac 1420 ARVOsxマルチラベルカウンタ），シェイカー
2. 試薬
・ＰＢＳ
・ 5倍濃 細胞溶解剤（東洋インキ）．．．PBSにて５倍希釈により使用
・ 発光基質PGL-100（東洋インキ） 混合して発光基質液として使用
・ 緩衝液 PGB-100（東洋インキ） （残ったものは-80℃で保存可能）
【home made細胞溶解剤・発光基質】
・細胞溶解剤：25mM Tris-HCl (pH 7.0-8.0), 2mM DTT, 2mM CDTA (pH 7.0), 10% Glycerol, 1% TritonX, 4mM MgCl2, 4 mM EGTA, 0.2mM PMSF)
・発光基質：20mM Tricine, 1.07mM (MgCO3)4Mg(OH)2-5H2O, 2.67 mM MgSO4, 0.1mM EDTA, 33.3 mM DTT, 270uM Coenzyme A, 470 uM luciferin, 530uM ATP
3. プロトコール
レポーター，エフェクタープラスミドの作製
※ レポータープラスミド：ピッカジーン・ベーシックベクター（東洋インキ）を使用．
細胞のプレーティング：トランスフェクションの前日，24 wellプレートに細胞を60～80%コンフルエントになるようにまく．
トランスフェクション（『培養細胞への遺伝子導入法』項目参照）
※internal controlとしては，β-ガラクトシダーゼ遺伝子に各種プロモーター（RSV, SV40, CMV プロモーターなど）をつないだプラスミドを使用．
37℃-CO2インキュベーターで24 hr～48 hr培養
細胞抽出液の調整：培養液を除去してPBSで洗浄後，PBSで希釈済の細胞溶解剤を 100 ul/well 加え，シェイカーを用いて10分間程度室温にて細胞を溶解する．
ルシフェラーゼ活性の測定：
（1） 細胞溶解液20 mlを測定用の96well白色プレート（ﾌﾙｵﾚｯｾﾝｽ/ﾙﾐﾈｯｾﾝｽ ｿﾘｯﾄﾞｱｯｾｲ96ｳｪﾙﾌﾟﾚｰﾄ (CORNING)）へ写す．
（2）プレートと発光基質液（発光基質PGL-100＋緩衝液 PGB-100）をマルチラベルカウンタへセットしルシフェラーゼ活性を測定する．
※ 発光基質の使用量の目安は，
（50 ul / well + マルチラベルカウンタへの充填分）ul＝（50（n） + 1500）ul
※マルチラベルカウンタの詳しい使用法は取扱説明書に従う
【測定プロトコール】以下の設定をおこなったプロトコールを使用して測定を行っている．
・ Sample : 全て「Measured」
・ Measurement : By well
・ Dispense: 「Injector」．．．1
「Volume」．．．50
「Speed」．．．3 sec
「Injection mode」．．．aspVol=dispVol
（3）β-ガラクトシダーゼ・アッセイによりinternal control activityを測定する．
（4）Luciferase activity / internal control activityによりrelative luciferase activityを求める．