In situ hybridization（齊藤 知子）
【原理】
目的の遺伝子のmRNAに対して，標識した配列相補的プローブをhybridizeさせることで，原位置(in situ)を同定する．プローブは最も感度の良いRNAプローブを用い、標識にはノンアイソトープとしてDIGを用いている。
以下のプロトコールは，発現の高いトランスジェニックマウスの組織を用いた場合の，外来遺伝子の発現を組織上 (in situ)で同定した時のものである．内在遺伝子の発現や発現の低い遺伝子を見る場合は，組織切片の包埋法や試薬の組成なども変わってくることがあるので，留意すること．
準備
1) 試薬・RNase freeの器具
2) 組織切片
4%パラホルムアルデヒド-PBによる還流固定，アルコール脱水，キシレン透徹の後，パラフィン包埋
したものを3-8_mぐらいの厚さで，切片を作製．詳しくは，組織切片作成法を参照．
3) RNA probeの作製
DIG-labeled RNA probeを用いた方法
plasmidの直鎖化
c.c.c.DNA 5 ug
10×buffer 5 ul
H2O x ul
5'突出になる酵素（3'は駄目）30U分
total 50ul by s.d. H2O
↓37℃ incubate
↓2ulを電気泳動でチェックする(control; cutしていないplasmid)
↓for RNA用のフェノクロ・エタ沈・リンス（3回）dry up
↓1ug/ulになるようにRNA用のs.d. H2Oにとかす．（O.D. Check）
in vitro transcription for labeling
（DIG-RNA labeling kit<cat. no. 1175 025>, BOEHRINGER MANNHEIM, 53000円/20回）
H2O (not DEPC H2O) 13 ul
10×Transcription buffer 2 ul
10×DIG-RNA labeling mixture 2 ul
linearized template DNA（1 ug/ul） 1 ul
RNase inhibiter（20 U/ul; 代用可能） 1 ul
RNA polymerase（T7, T3, SP6;代用可能）（20 U/ul） 1 ul
Total 20ul
↓
37℃，120min.(in vitro transcription 反応)
1ulを取って置き電気泳動でチェックする.(a)
Rnase free DNase (Promega ) 1 ul
tRNA (10ug/ul in DEPC H2O) 2 ul
RNase inhibiter（20 U/ul; 代用可能） 1 ul
↓
37℃，30min.(template DNAの除去)
1ul取って置き電気泳動でチェックする. (b)
TE (10mM Tris-HCl pH7.6, 1mM EDTA)75.8 ul
3M NaOAc (pH5.2) 10 ul
100% EtOH 250 ul
glycogen (20 ug/ul) 2ul or Ethatine mate 1 ul
-80 ℃ 5min.(エタ沈)
↓
↓14000 rpm. ,4 ℃, 5min.
↓sup.
↓70% EtOH 500 ul
↓14000 rpm. ,4 ℃, 3-5min.
↓dry up 1min.(乾かしすぎない)
↓DEPC H2O 500ulにとかす．
(a), (b)を一緒に電気泳動で流しプローブの合成と，template DNAの除去を確認する．
spot 法によるprobe量の見積もり
sample control RNA labeled 0.1ug/ul (Kit内にある)
調整したprobe
ピンセット，金属バット（小）2コ，50 ml メスシリンダー，50 ml 三角フラスコ，スターラーバー
各RNA probe 1ulを，順に1/5，1/25，1/125，1/625，1/3125とDEPC H2Oで希釈して，ナイロンメンブレンに1ulずつspot する． 風乾
（発色反応）全て室温にて．
↓DIG buffer I (10mM Tris-HCl (pH 7.5), 15mM NaCl) 15ml 1min.
↓0.5% blocking reagent (0.1g Milk powder in DIG buffer I 20ml) 20ml 30min.
↓DIG buffer I 15ml wash
↓Anti DIG antibody solution (×400 DIG antibody in DIG buffer I 5ml; ×20000) 30min.
*抗体の希釈は使う直前に
↓DIG buffer I 15ml wash 2times
↓DIG buffer III (100mM Tris-HCl (pH9.5), 100mM NaCl, 50mM MgCl2) 15ml 2min.
↓染色液 (NBT 20ul, X-Phosphate 10ul,DIG buffer III 5ml 30min.以上～O/N(暗下)
*染色液は使う直前に作製
*染色バットは，共洗いしながら交互に使うこと．
in situ hybridization の実際
準備；実際行う前に，それぞれの項目において試薬，器具の用意をしておく．器具の準備を最初に記載しておくが，後の手順の中に試薬の組成を含めておく．
1) 前処理
(乾熱)１メスシリンダー×1，250mlメスシリンダー×2，500ｍｌビーカー×1，スライドグラスラック×1，ピンセット×1, (A.C)スターラーバー×1，染色壺×14
proteinase K 6mg/ml 600ul を37℃へ．
その30min後，反応開始．
Xylen 1 10min.
Xylen 2 10min.
100% EtOH 15sec.
90% EtOH 15sec.
80% EtOH 15sec.
70% EtOH 15sec.
PB 0.1M pH7.4 (NaHPO4(0.5M)とNaH2PO4(0.5M)を加えて，pH7.4 にしてからfill up to 180ml by DEPC H2O) 15sec.
PB 15sec.
4%パラホルムアルデヒド/PB (パラホルムアルデヒド7.2gをfill up to 180ml by PB) 15min.
proteinase K 20ug/ml (先ほどあたためておいたproteinase K を100mM Tris-HCl (pH8.0)，10mM EDTA
18mlを加えて，fill up to 180ml by DEPC H2O)を染色壺ごと37℃，5min.
4%パラホルムアルデヒド/PB 10min.
PB 1min.
0.2M HCl (12M HCl(塩酸) 3mlをfill up to 180ml by DEPC H2O) 10min.
PB 1min.
0.1M TEA (2M TEA 9ml fill up to 180ml by DEPC H2O) 1min.
0.1M TEA/0.25% Acetic Anhydride (2M TEA 9ml, Acetic Anhydride 450ul fill up to 180ml by DEPC H2O) 10min.
*遮光で
70% EtOH 15sec.
80% EtOH 15sec.
90% EtOH 15sec.
100% EtOH 15sec.
100% EtOH 15sec.
風乾 30-60min. (その間にhybridizationの準備)
2)hybridization
・ モイスチャーチャンバー（ガラス棒はエタノールで拭いておく，また，その中にキムタオルを敷き，50%ホルムアミド/ DEPC H2O 50 mlをしみこませて，ガラス棒を置き60℃のエアインキュベーターヘ）一つで10枚のスライドグラスが入る．）
・ 85℃の水
・パラフィルム（スライドグラス枚数分，ハイブリする面積分を切っておく）
hybri buffer
50% form amide，0.75M NaCl，10mM PIPES (pH6.8)，1mM EDTA，100ug/ml，0.05％heparin，
0.1％BSA，1%SDS，fill up by DEPC H2O 一枚あたり，50ul必要
*この組成は，あくまでも一例であり，この限りではない．文献をよく調べること．
↓85℃
↓×10-×100になるようにsense or antisense probeを加える．
↓85℃，3min.
↓スライドクラスへ滴下，パラフィルムで覆い，モイストチャンバーへ
↓50℃，16-24hr.
3) wash
(乾熱)500ml メスシリンダー×1，1メスシリンダー×1，250ml メスシリンダー×2，300ml三角フラスコ×1，スライドグラスラック×1，縦長の中バット×1，(A.C.)スターラーバー×1，染色壺×7，50℃のインキュベーター×2，37℃のインキュベーター×1
5×SSC (20×SSC 75ml fill up to 300ml by s.d. H2O バットに入れる) 50℃ スライドグラスを入れて
パラフィルムが浮いたら次の染色壺へ
2×SSC/50% ホルムアミド 50℃ 30min.
1×TNE (10×TNE fill up to s.d. H2O) 37℃ 10min.
10ug/ml RNase A/1×TNE 37℃ 30min.
1×TNE 37℃ 10min.
2×SSC 50℃ 20min.
0.2×SSC 50℃ 20min.
0.2×SSC 50℃ 20min.
4) 抗体反応・発色反応
DIG I buffer 5min.
1.5% blocking reagent (Milk Powder 2.7g，DIG I buffer 180ml) 60min
*この間に，antibody solution (×500) / 0.2% Tween 20を作製．
Anti DIG antibody 0.4ul
Tween 20 0.4ul
DIG I Buffer 199.2ul
スライド一枚あたり200ul
Anti-DIG antibody/0.2% Tween 20 30min.
DIG I buffer / 0.2% Tween 20 wash 15min.
DIG I buffer / 0.2% Tween 20 wash 15min.
DIG III buffer 3min.
発色基質solution 200ulをのせて，前のチャンバーに入れ，アルミで覆って静置 18-36hr.
発色基質solution
NBT(75mg/ml) 0.9ul
BCIP (50mg/ml) 0.7ul
DIG III Buffer 198.4ul
スライド一枚あたり200ul
2) 観察・撮影
反応停止液 (100mM Tris-HCl (pH7.6 or 8.0)/10mM EDTA 18ml fill up to 180ml by s.d. H2O)
反応停止液 3min.
s.d. H2O wash
クリスタルマウント(水性)で，封入しカバーグラスをして観察・撮影．
s.d. H2Oにつけてカバーグラスをはずす．
メチルグリーン 5min.
D.W. wash 2times
100% EtOH 2.3回up down
D.W 2.3回up down
封入して撮影