<Phenol/CHCl3 method>
Day 1
↓ cut + put tail (0.5-1cm) into 1.5 ml tube
↓ add 665 ml of Tail buffer + 35 ml of Proteinase K (6 mg/ ml)
↓ Check tail is at the bottom of the tube.
↓ inversion
↓ 60℃ (O/N)
Day 2
↓ spin down
↓ add 700 ml (same vol.) of Phenol/CHCl3
↓ rotate at RT (over 1h) ＊tube のフタにキャップをつける
↓ cfg. (14,000 rpm, 20℃, 10 min) + transfer sup.
sup.
↓ add 5 ml of Rnase A (1mg/ ml)
↓ inversion
↓ 37℃ (over 30 min) ＊air incubator の時は暖まりにくいので 40 min 以上
↓ add 600 ml (same vol.) of Phenol/CHCl3
↓ rotate at RT (over 1h)
↓ cfg. (14,000 rpm, 20℃, 10 min) + transfer sup.
sup.
↓ add 400 ml (same vol.) of IpOH
↓ inversion
↓ cfg. (14,000 rpm, 4℃, 10 min) + remove sup. (decant)
pellet
↓ 70% EtOH rinse + dry
↓ dissolve in 300 ml of TE*1
↓ 4℃ stock
*1) すぐに使用する時は TE を加えた後、vortex + spin down
すぐに使用しない時は vortex ではなく、4℃ (O/N) にて DNA を溶かす
(vortex では DNA が物理的に分断される可能性がある為)
・ Reagent and medium
1) Tail buffer
1M Tris-HCl (pH 7.4) 25 ml
0.5M EDTA (pH 8.0) 100 ml
5M NaCl 10 ml
10% SDS 50 ml
sd. MilliQ-H2O 315 ml
500 ml
<NH4OAc method>
Day 1
↓ cut + put tail (0.5-1cm) into 1.5 ml tube
↓ add 300 ml of Tail buffer + 20 ml of Proteinase K (6 mg/ ml)
↓ 60 ℃ (O/N) ＊途中で数回inversion
Day 2
↓ cool to RT
↓ add 20 ml of 1 mg /ml RNase A ＊20～30 ml 加える様にRNase Aを希釈
↓ 37℃ (30-40 min)
↓ cool to RT*1
↓ add 100 ml of 7.5M NH4OAc
↓ vortex at maximum speed (30 min)
↓ on ice (over 5 min)
↓ cfg. (14,000 rpm. RT. 10 min)
↓ transfer sup. to new tube containing 300 ml (same vol.) of IpOH (decant)
↓ inversion
↓ cfg. (14,000 rpm. 4℃. 10 min)
↓ rinse, dry
↓ 300 ml of TE
↓ 4℃ stock
*1) RTに戻さないとタンパクのペレットがもろくなり、IpOH ppt.のDNAにタンパクがコンタミする
