Radioimmuno assay for Renin-angiotensin system（齊藤 知子）

 

<原理>
　あるタンパクの量を測定したい場合に，放射線標識した既知濃度の同じタンパクを用いて，それに対する抗体を競合的あるいは，非競合的に結合させ，未知の標本の濃度を決定する．マウスやヒトの個体を用いた場合，個体間のばらつきが大きい上に，酵素抗体反応が基本の定量実験であるため，条件検討のためのpre実験をしていかなくてはならない．さらに，最終的なデーターをとる時には，一回の実験において全てを行うことで，反応条件を一定にし，データーのばらつきを最小限にする．すなわち，pre実験できっちり条件が決まれば，後は一気に本実験を行えばいいのである．そこで，pre実験の条件検討を中心に記載した．以下のプロトコールは，下図の A)-E)についてのものである．
注）incubate以外は，全てon iceで行うこと．

☆Radioimmuno assay (RIA)の流れ

A，AI量
Pre 実験　radioimmunoassayにおける検量線内に入るplasma もしくはtissue extractsの量の条件を決定する．

Plasma もしくはtissue extracts　5-95ulの間でふる．
5mM PMSF
5mM EDTA
AI generation buffer　　　　　　　　　　　　　　　　
Total 100ulを2連でRadioimmunoassayにもっていく．

検量線に収まる量を本実験の条件とする．

B，hAGまたはmAG濃度
Pre実験　基質であるhAGとmAGの濃度を求めるため，さらに酵素reninを加えて，全てAIにしてから，その濃度を決定する方法である．
　　　　Pre 実験では1)加えるレニン活性の測定と，基質溶液となるsampleに対して，2)過剰量になるrenin量の条件を決定する．

1) レニン活性の測定
レニンsolution 25ul レニンをRIA bufferで希釈したもの．基質溶液の1/10量を加える．
Hog Substrate solution 225μl Hog substrate (75ng)，5mM EDTA，5mM PMSF fill up by AI generation buffer
total 250ul×レニンsolution を希釈した本数分（レニンを加えないものも含む）

↓37℃，60min.
↓on ice
↓×1，×10，×100にRIA bufferにて希釈して，それぞれ100ul分を２連でRadioimmunoassayにもっていく．

一番大きな値が出たrotのレニンを，assayに用いる．
注）結果の値は，レニンを加えなかったときの値を引いたもので求められる．単位はng AI/ml renin solution / hr また，加える酵素と基質の種特異性に注意すること．

2) 過剰となるRN量
今までの文献からsampleに含まれるAG量を推定する．1)で決定したrotのレニンを用いて，その推定値から10倍の活性を持つレニン量を加えるようにする．

レニンsolution 25ul
plasma もしくはtissue extract 加える量は以前の経験値による
5mM PMSF
5mM EDTA
AI generation buffer
total 250ul×時間数分

↓37℃，0，20，40，60，90min.ほど，時間をふる．
↓on ice
↓×1，×10，×100にRIA bufferにて希釈して，それぞれ100ul分を2連でRadioimmunoassayに持っていく．



上図で示したような時間と，加えたレニン量が本実験での条件となる．
注）結果の値は，もともとサンプル中に含まれる，AI量を引いた後，（incubate 0min.の値を引く．）
×50にすることで求められる．AG (60000; M.W.)/AI (1296.5; M.W.)=50より　単位はng AG量/ml plasma or mg protein of tissue

C，血漿レニン濃度(PRC)
Pre実験　Plasma中に含まれる最大レニン活性を求めるため，外から過剰量となる基質(AG)を加えなくてはならない．その条件を検討する．外から加える基質量は，経験値　　　　のPRAを参考にして加えてみる．

Plasma solution 25ul plasmaをRIA bufferで希釈したもの．基質溶液の1/10量を加える．
Hog Substrate solution 225μl Hog substrate (量は，経験値を参考に)，5mM EDTA，5mM PMSF fill
　　　up by AI generation buffer
total 250ul×(hog substrateの量+時間)分

↓37℃，0，40，60，90min.ほど，時間をふる．
↓on ice
↓×1，×10，×100にRIA bufferにて希釈して，それぞれ100ul分を2連でRadioimmunoassayにもっていく．



一定量のsubstrateに対する，それぞれの反応時間を60min.あたりのAI量に換算して，一番大きい値が出た時間をその濃度のPRCとして，上図のようにグラフを作った場合，示したポイントを本実験の条件に決定する．また，検量線の範囲に入った希釈濃度も本実験の条件にする．
注）結果の値は，もともとサンプル中に含まれる，AI量を引くことで求められる．（incubate 0min.の値を引く．）単位はng AI/ ml plasma or mg protein of tissue/ hr

D，血漿レニン活性（PRA）(Plasma に含まれるレニン活性 ; plasma中に存在する基質の濃度にも左右される)
Pre実験　　　一時間あたりの最大AI 生成量であるので（AIを作りうるレニンの能力）
　　　　　　 1. 反応速度の高い条件
　　　　　　 2. 検量線に収まるplasmaの量の条件　を求める．

AI generation buffer で希釈したplasma
5mM EDTA
5mM PNSF
total 250ul×時間数分

↓37℃，0，40，60，90min.ほど，時間をふる．
↓on ice
↓×1，×10，×100にRIA bufferにて希釈して，それぞれ100ul分を2連でRadioimmunoassayにもっていく．

それぞれの反応時間を，60min.あたりのAI量に換算して，一番大きい値が出たincubate 時間 (すなわち，AI生成速度が一番大きいということ)を本実験の条件に決定する．また，検量線の範囲に入った希釈濃度も本実験の条件にする．
注）結果の値は，もともとサンプル中に含まれる，AI量を引くことで求められる．（incubate 0min.の値を引く．）単位はng AI/ ml plasma or mg protein of tissue/ hr

Radioimmunoassay for AI
Sampleは上記で示したように，全て100ul分を用いる．また，RIAでは，total 1mlのvolumeで抗体反応を行う．AI抗体を用いたRIAの場合を記載する．

そろえるもの(各2連で)

・T(total)　　　　RIA buffer 900u 加えたラベルAI量
・CB(Charcoal blank) RIA buffer 900ul Charcoalに結合するラベルAI量
・Z(zero sample) RIA buffer 100ul+抗体solution 800ul 抗体に結合するラベルAI量
・Standard (6つの濃度) standard100ul+抗体solution 800ul 検量線のためのもの
・Sample(測定する対象) sample100ul+抗体solution 800ul

*standardは，既知濃度(41，82，163，325，650，1300pg/100ul )のAIをRIAbufferで希釈したもの
*抗体solution は50ulのAI抗体+750ulのRIA bufferである．

上記のものを実験室でそろえてから，RIにて行う．

↓すべてに125I-AI 100ul(count 10000-120000)を加えて，4℃，8-12hr. (125I-AI;第一化学薬品　NEX-101)
↓T以外にCharcoal 1mlを加えてVortex 　　　抗体に結合しなかったものが吸着
↓4℃，3000rpm,10min.
↓sup回収
↓γ-counterにてcount

E, Radioimmunoassay for human renin
ヒトレニンに対する2種類の抗体でサンドイッチすることで測定できるキットがある．
(レニンIRMA 「第一」；273-000 TFB)
説明書に準ずる．
Pre実験としては検量線にのるsample量を検討する．