はじめに
Northern blottingはmRNAの量、大きさなどを調べる最もオーソドックスな方法である。当研究室では、グリオキサールで変性させたRNAをアガロースゲルにて電気泳動・分離後、フィルターにトランスファーし、α32P[dCTP]で標識したDNA probeで検出する方法で行なっている。
概要
１． 電気泳動槽及びコームのH2O2処理、ゲルの作製
２． サンプルの調整（RNAの変性）、電気泳動
３． EtBr処理・酸性処理、ゲル写真撮影
４． トランスファー(Blotting)
５． グリオキサール解除・メンブレン処理
６． prehybridization, hybridization
７． メンブレンの洗浄・検出
８． トラブルシューティング
試薬
50×TAE (pH7.0)
Tris-hydroxymethl-amiomethane 72.2g
Sodium-acetate 24.6g
EDTA-2Na 5.58g
H2O（MilliQ） to 500ml 酢酸にてpH 7.0に合わせる。
6×Dye (For RNA)
Bromophenol blue 25mg
10xTAE 6ml
glycerol 4ml
10ml
5% 過酸化水素水
H2O2 (30%)･････170ml
H2O (DW) ･････830ml
1000ml
20×SSC
NaCl 175.3g
Na3 citrate･2 H2O 88.2g
H2O (DW) to 1000ml
操作手順
1. 電気泳動槽及びコームの過酸化水素水処理、ゲルの作製
電気泳動槽及びコームのH2O2処理
電気泳動槽、コーム、ゲル固定容器を5% 過酸化水素水に1 hr以上浸しておく。
(当研究室では、三角フラスコに室温で保存し、再利用している。)
DWでよく濯いでペーパータオルで拭き、乾燥させる。
ゲルの作製
1.2% Agarose (150ml)の作製方法
DW 147ml
50×TAE (pH7.0) 3ml
Agarose 1.8g
オートクレーブ(120℃、15min)もしくは電子レンジにてagarose-gelを作製する。
容器に注ぎ、空気が入らないようにコームをさす。
室温にて放置、ゲルが白く固まったら完成
2. サンプルの調整（RNAの変性）
RNAサンプルをエッペンにて調整する。
standard Small scale
RNA sample(5～20mg) 5.6 ml 2.3 ml
10×TAE (pH7.0) 2.4 ml 1.0 ml
glyoxal 4 ml 1.7 ml
DMSO 12 ml 5.0 ml
24 ml 10ml
・RNA sampleの容量はDEPC H2Oで合わせる
・10×TAE (pH7.0)はストックの50×TAE (pH7.0)をDEPC H2Oで希釈して使用
・当研究室ではglyoxalをresinにてpHを調整した後、1.5mlチューブに100 mlずつ分注し、－80℃にストックしたものを用いている。またglyoxalのpH変化を防ぐため、glyoxalは一回使い切りにしている。
50℃ 1hr（きっかり）, on ice
6×Dyeを加えて、全量をapplyする。
パワーサプライにて60mAで約10分電気泳動した後（stacking）、50mAで2～3時間、電気泳動する。（ミューピットにて電気泳動後、ハイブリまでもっていっても問題はない。検出したいものに合わせてRNA量や電気泳動時間などの条件を変えること。）
3. EtBr処理・酸性処理
50mM NaCl/12.5ug/ml EtBr、室温にて20分以上処理
（金属バットにゲルを入れて静かにゆらす。）
0.2M sodium acetate (pH4.0) 、室温にて20分以上処理
（金属バットにゲルを入れて静かにゆらす。）
写真撮影：scaleを横におく。＝28S、18Sの位置から目的のmRNAの大きさをおおよそであるが、確認できる。
4. トランスファー(Blotting)
金属バットにゲルを入れて10×SSC Bufferで15分間静かにゆらす。図のようにブロッティング装置をセットする。8時間以上
5. グリオキサール解除・メンブレン処理
gene screen plus (メンブレン)上のwellの位置にボールペンで印を入れていく。
50mM NaCl にて15秒間処理＝脱グリオキサール
1xSSC/0.2M Tris-HCl(pH7.5) にて30秒間処理
キムタオルの上で水気を切り、メンブレンを風乾させる。
このまま長期にわたり保存したいときには、prehybriの時間を通常よりも長く行なう。
6. Prehybridization / Hybridization
Prehybridization
55℃～65℃、prehy soln(1%SDS, 1M NaCl, 10% Dextran)中にて30分から60分処理
↓(Hybripackにメンブレンとprehy soln(メンブレンの大きさや実験による：5～20ml)を入れる（空気が入らないように）。
↓55℃～65℃のウオーターインキュベーター底にHybripackごと沈める。
Hybridization
↓プレハイ処理後、prehy solnを全て捨る（捨てずにやっても良い）。以下に示すhybri solnを加える。
hybri soln
ssDNA(実験系によるが、終濃度300ug/ulで行なっている。)
probe DNA (105cpm/ml以上)
prehy soln(1%SDS, 1M NaCl, 10% Dextran) 5～20ｍｌ
↓メンブレンが入っているHybripackから空気を追い出し、シーラーで2重にして止める。
(空気が残るとその部分にprobeがhybridizationしなくなる可能性がある。)
↓新しいHybripackでさらに覆い、シーラーで2重にして止める。
↓55℃～65℃のウオーターインキュベーター底にHybripackごと沈める。
↓8時間以上(静置または穏やかにshake)
7. メンブレンの洗浄・検出
実験の目的やprobeの良し悪しにもよるが、当研究室では以下の試薬・条件を標準的なWashingの条件としている。
↓2xSSC, RT, 5min with shaking(2回)
↓2xSSC/1%SDS, 55℃～65℃,10~30min
(Water incubator上に金属バットに洗浄液をいれて) (2回)
↓0.1xSSC, RT, 5~15min shaking(2回)
検出
オートラの場合
(メンブレンをラップに包み、増感紙を用いて-80℃で数日間、X線フィルムで感光させる。)
イメージングプレートの場合
（メンブレンをラップに包み、イメージングプレートに感光させ、Tyhoon8600やBAS2000にて検出を行なう。）
トラブルシューティング
問題があれば、以下の事を確認する。
プローブが高い比活性で標識されているか？
RNAサンプルの状態はどうか（トラブルの原因はここにあることが多い）？
→EtBr写真で確認したrRNAのバンドの比率が28S：18S＝2（3）：1くらいなら良い。
RT-PCRなどで目的のRNAの存在を確認する。
自分の目的の遺伝子をノーザンで検出したpaperがないか調べてみる。マテメソ熟読！
Probeの相同性に見合ったhybri・washing条件を組み立てる。（塩濃度や温度）
Probeに反復配列やGCが多い配列が含まれていないか？
設計したprobeが目的の遺伝子特異的かどうか? データーベース等で調べてみる。