免疫沈降法（大徳 浩照）
免疫沈降法は、特異抗体を用いて細胞抽出液などの雑多なタンパク溶液から目的とするタンパクを精製する方法である。特異抗体がない、あるいは免疫沈降に適さない場合でも、目的タンパクにFLAG, HAなどのepitope-tagを付加することで免疫沈降を行うことが可能になる。また、免疫沈降物複合体に含まれる他のタンパクは、in vivoにおいて目的タンパクと相互作用しうる因子と見なすことができる（共沈: co-I.P.）。in vivoにおけるタンパク間相互作用を証明するためには、T.F.による過剰発現系よりも、内在発現レベルでの共沈を示すことが望ましい（けれど難しい）。
I. 成功の秘訣
◯ 細胞の種類、培養条件、刺激の有無など、タンパク間相互作用を変化させうる要因は様々なので、根気強い検討が必要である。
◯ 抗体の質によっては、どうやってもうまくいかない場合もあるので、他のメーカーの抗体を試すなど、柔軟に対応すべきである。
◯ それでもダメならタグつきタンパク発現系で検討する。ただ過剰発現系では、non-specificな結合が検出されやすいので、negative controlの取り方が重要になってくる。また投稿する雑誌によっては内在性の相互作用検出が必須になることが多い。
II. 方法/直径10 cm dishの場合
A) 細胞抽出液の調製 （on ice, または低温室にて操作）
1）dishから培地を除去し、cold-PBSで２回washして、よく水分をきる。
2）Lysis buffer 1 mlをdishに加え、ラバーポリスマンで細胞を掻き取る。
3）細胞懸濁液をエッペンチューブに移し、on iceで15～30 min/5 min 毎にinversion
4）max speed で4℃, 30 min 遠心
5）上清をlysateとする。
B) Immunoprecipitation
6）protein G sepharoseを60 ulずつ入れて2hr rotate at 4℃
7）5000 rpm, 3 min 遠心 at 4℃
8）上清を新しいチューブに移し、抗体を加える。
9）3 hr～O/N rotate at 4℃
10）protein G sepharoseを40 ulずつ加える。
11）1hr rotate at 4℃
12) wash 4回
13）ビーズを2×SDS sample bufferに懸濁、100℃, 5 min 処理してsampleとする。
III. 補足
1）bufferは用途により様々であるが、当研究室でよく使うbufferの組成を以下に示す。
（Lysis buffer組成） 20mM HEPES-HCL (pH 7.9)/ 1% NP-40 /0.15M NaCl /1mM EDTA /protease inhibitors
3）rotateしてもよい。
4）不溶性画分を完全に除去するため、十分に遠心する。
6）protein G に結合するnon-specific なものを取り除くため (preclean)。protein G sepharoseはlysis bufferに平衡化しておき、50% slurryの状態で使用する。従って60 ulはbed vol.で30 ulである。また、この時さらに正常IgG （マウス、ラビットなど）を添加すれば、IgGに非特異に結合するものも除去できる。
8）加える抗体量は至適化する必要があるが、一般的に2～5 ugぐらいでよいのではないか。多すぎると、no-specificが増えるうえにコストが高くつく。
IV. 参考
東京大学 分子細胞学研究所 核内情報研究分野 加藤研究室 ラボマニュアル