Gel shift assay（廣田 恵子）
A. Probe作製
T4 poly nucleotide kinaseによる5'-end labeling法とklenowによるfill-in labeling法がある。
ここでは5'-end labeling法について概説する。
1. Probeとする2本鎖DNAの準備
2. DNA fragment 1 ul (50 ng)
Protruding(or Blunting) end PNK buffer 5 ul
Poly Nucleotide Kinase 2 ul
γ-32P ATP 3 ul
MilliQ 39 ul
37℃ 1hr.以上 incubation
# 実験室でγ-32P ATP以外を混ぜてon iceでRIへ行き、γ-32P ATPを加えてインキュベーターへ。
3. インキュベート後サンプルをG50カラムに注ぎ、cfg.2000 rpm. 30 sec.
TES buffer* 50 ulを上から注ぎ、cfg.2000 rpm.30 sec.これを２回行う。
回収されたProbe (150 ul 程度のはず) をチェレンコフで測定する。
TEにてProbe 1 ul : 1×10の4～5乗×10の4乗cpmになるように調製して使用する。
B. Proteinの調製
C. Binding reaction
1.reaction mixtureの作製#
2×binding buffer* 10 ul
polydI-dC 0.5～2 ug
competitor ×100～200倍程度
probe
MilliQでTotal 20 ulに調製
#Proteinの種類によってはCa2+、Mg2+、Zn2+のような２価金属イオンがDNAとの結合に影響することがある。
#Probe以外を実験室で調整し、On iceでRIへ行き、Probeを加える。
2. On Ice 10から30min
D. 電気泳動*
5%非変性ポリアクリルアミドゲル# (14レーンコーム)
130V 150min 4℃1×TBEにて泳動。
#2.5～5% glycerolを加えることもある。
#泳動バッファーは結果を左右することがあるので、うまくいかないときは条件を検討するのがよいと思う。低イオン強度バッファーの方がDNA-Protein複合体を安定化できるらしい。ただし、ペリスタポンプにて泳動中、上下槽のバッファーを循環させることが必要である。
E. ゲル乾燥
F. 検出
*TES buffer
*2×binding buffer
24 mM Hepes (pH 7.9)
120 mM KCl
8 mM MgCl2
2 mM EDTA
24% glycerol
2 mM DTT
5 mM PMSF