GST-pull down assay（山形 一行）
目的
目的のタンパク質同士が結合するか in vitro で確かめるアッセイ。主にタンパク-タンパク間の結合領域を調べるのに用いられる。目的のタンパク (すなわち GST-fusion タンパクに "pull" される側) は細胞に過剰発現させる場合とReticulocyte Lysate にて in vitro で 35S- メチオニンでラベルして合成させる場合がある。ところで、筆者が調べていた SHP というタンパクにはメチオニンが一つしか無く後者の方法は向かなかったため、ほぼ全て前者の系で行っていた。そこで今回は細胞に過剰発現させたときの系を中心に紹介する。
<大まかな流れ>
↓細胞に目的タンパクの遺伝子を導入
↓GST-fusion protein の回収～濃度チェック
↓目的タンパクを発現させた細胞と GST-fusion protein を混ぜる
↓SDS-PAGE ～ Western blotting にて目的のタンパクを検出
遺伝子導入 (293T cells in 10 cmf dish)
↓目的のDNA (c.c.c.) 4ug (条件により減らしても良い) in tube
↓mix them in tube & pipette well
OPTI-MEM 400ul
FuGENE6 12ul
↓15min 放置
↓add pre-mix/plasmid all to 293T cell, mix gently
↓48hrs incubate
↓FKHRの系で核の局在が必要なときは24hrs後に無血清培地に交換する
↓check 293T cell
タンパク回収
以下、FKHRの系として説明する
↓make Lysis buffer (without inhibitor)
20mM Hepes (pH7.2)
150mM KCl (条件により可変)
0.1% NP-40 (条件により可変)
1mM DTT
↓add Lysis buffer 960ul to tube
↓add 25×inhibitor comp. 40ul to tube
(cell lysis buffer with inhibitorの完成)
↓bring rubber stick, pipette man, biker(to discard medium),cell &ice box to 4℃ room
↓discard medium (紙で水気をよく切る)
↓PBS wash, gently
↓add cell lysis buffer 1ml, scrape cell (特に隅を入念に、下に落とすように)
↓move cell lysis to tube
↓rot. 4℃ (15~)30min.
↓cfg. MAX, 15min.
↓preclean
↓チューブに50% slurry glutathione-Sepharose beads 100ul (条件により増減可) 用意
↓add all the sup to new tube (within glutathione-sepharose beads)
↓rot. 4℃ (30min.~)1hr (ノンスペが残るようなら延長可)
↓cfg. MAX, (15~)30min.
Pull-down
このステップで回収した細胞抽出液とあらかじめ回収しておいた GST-fusion タンパクを混ぜる。
↓preclean 遠心中にpull down用のtube 用意 (下に例を示した)
CBB染色でGST-fusionタンパクの濃度を決定する。各々のタンパク量を揃え (例 : 10ug) 、50% slurry で 50ul (これも条件により可変) になるよう空ビーズ (50 % slurry) で合わせる。
1.GST
2.GST-SHP full
3.GST-SHP-N1
4.GST-SHP-N2
5.GST-SHP-W160X
6.GST-SHP-C
↓add the sup to tubes equally (均等<例150ul >に。別にINPUT用にtube1本分の10%量<例 15ul>を取り、2×SDS bufferを等量加える)
↓add cell Lysis buffer (with inhibitor comp.) up to 400ul (あまり液量が少ないと混ざりにくい)
↓rot. (2~)4hrs (条件により増減可能)
↓spin down and wash the protein-beads complexes by Lysis buffer ×3
↓水分をギリギリまで捨て、2×SDS bufferを加えてサンプル変性 (サンプルの完成)
タンパクの泳動～検出
↓heat denature
↓apply the samples
↓SDS-PAGE
↓Blotting
↓Blocking
↓一次抗体～二次抗体～wash
↓暗室にて現像
データの解析
ちなみに、 In vitro translation で Pull-down をする場合も基本的な操作は一緒である。ただ、細胞を準備する手間が省けるのと、タンパクの検出を RI で行う点が異なる。In vitro translation については松崎さんの詳しい解説つきのプロトコールを参照してください。