ABCD assay（山形 一行）
目的と原理
目的のDNA-protein 間の結合を検出する方法の一つ。目的の塩基配列を含んだビオチン化sense 及び anti-sense oligo DNA をアニールさせ、二本鎖 DNA にした後、アビジンビーズに結合させる。DNA-beads とDNA との結合を見たいタンパクを含んだ溶液 ( GST-protein , cell lysate 等 ) と混ぜて、beads-DNA-protein complex を形成させる。それを SDS-PAGE にて泳動し、Blotting した後に目的のタンパクの抗体でタンパクを検出する。
重要なポイント
1. oligo DNA のビオチン化
DNA結合タンパクの認識配列を含む20～60mer 程度のDNAを外注にて合成する。この時、5'または3'末端をビオチン化修飾してもらう。
ビオチン化修飾はsense or anti-sense DNA のどちらか一方で良い。
2. 二本鎖DNA-beads の調製
50% slurry beads 10ul あたり 50pmol の２本鎖DNA が必要である
(計算)
DNA のmol 濃度が分かっている場合
sense 及び anti-sense の oligo を100 pmol/ul に調製する。これを annealing させると 50 pmol/ul となるので 50% slurry beads 10ul につき annealing させた2本鎖 DNA が1ul必要となる。
DNA の質量が分かっている場合
30 mer の oligoでは 1ug = 101.58pmol ≒100pmol 、すなわち 100pmol/ul = 1ug/ul となる。これをAnnealing させた 2本鎖 DNA では 100pmol/ul = 2ug/ul すなわち 50pmol /ul = 1ug /ul となる。よって30 mer の場合では2本鎖 DNA 1ug を50% slurry beads 10ul に加えればよい。(参考: 60 mer のoligoの場合では 100pmol/ul = 1.9ug /ul)
100ul の系で行うので、50pmol /ul の2本鎖 DNA 10ul あたりアビジンビーズは beads にて50ul (50% slurry なら100ul) 必要になる計算となる。
＜大まかな流れ＞
↓ DNA annealing
↓ DNA との結合を見たいタンパクの準備
↓ DNA-beads とタンパクを混ぜる
↓ SDS-PAGE ～ Western blotting にて目的のタンパクを検出
DNA annealing
Mix 10ul of each 100pmol/ul (or 10ug) sense & anti-sense oligo DNA (3'-biotinated)
↓100℃ 5min (チューブ用の蓋をつけて。たまに蓋についた水分をおとす)
↓沸騰したお湯を断熱材に入れ、サンプルをフローターに乗せて40℃ まで自然放冷 (about 1hr)
放冷後、-20℃にて保存可能 (少なくとも1年はイケル)
この間に必要量のアビジンビーズ (TetraLinkTM Tetrameric Avidin Resin, Promega) をTE で wash し、50% slurry にする。
↓mix 10ul (10ug) of annealed DNA and 100ul of 50% slurry avidin beads together
↓R.T. 15min (時々tapping してよく混ぜる)
↓TE wash ×3 ～ 50% slurry
50% slurry DNA-beads も 4℃にて保存可能 (少なくとも1年はイケル)
この間にタンパク溶液の準備をする。ここでは細胞 (HepG2) を用いて内在のタンパク (FOXO1) が DNA (IRS配列) に結合するかをみる場合を示す
目的タンパクの準備
HepG2 10cmシャーレ 100%conf. At the cold room
↓wash cells 3 times by PBS
↓add 1ml of lysis Buffer
↓scrape cells into tube
↓rot. 15min
↓cfg. Max 15min
DNA-protein binding
↓collect the sup and add 30ul of 50% slurry avidin beads
↓pre-clean
rot. 20-30min at the cold room
↓cfg. Max 15min
この間に新しいチューブに on ice にて beads-DNA complex を 10ulずつ入れておく
↓collect 200ul of the sup to new tube, on ice.
ここでinput としてsup. を40ul 別のチューブに分注し、3×SDS buffer を 20ul加えて使用時まで冷蔵庫に保存
↓add 300ul of lysis buffer with protease inhibitor complete and 10ug of poly(dI-dC)
↓DNA-protein binding
rot. 20-30min at the cold room
↓cfg. 5000rpm 1min
↓wash the beads 3 times by lysis buffer ~ ppt.
ここで目的のbeads-DNA-protein complex ができる
DNA-protein の結合の有無の検出
↓SDS-PAGE
add 25ul (beads 量で加減する) of 2×SDS buffer ~ heat denature ~ electrophoresis
(参考: 7% ゲル、200V 35minにて泳動)
↓western blotting
(参考: セミドライ式にて)
↓blocking ~ １次抗体 (目的のタンパクの抗体) ~ ２次抗体 ~ 現像
↓データの解析！
ABCD assay lysis buffer
Hepes (pH 7.5) 20mM
KCl 100mM (条件により可変)
EDTA 0.5mM
TritonX 0.1% (条件により可変)
PMSF 1mM
DTT 1mM
MilliQ up to 10ml
Wash 用以外の時は必要量のprotease inhibitor complete を加える